Introducción

Cuando se incorporó la hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) al cribado neonatal, no se conocía bien su base molecular. Las alteraciones del gen CYP21A2 –causantes de la deficiencia de esteroide 21-hidroxilasa (HSC-21OHD), causa mayoritaria de la HSC, 95%– se describieron a partir de 1990⁽¹⁾, y se puso de manifiesto que un conjunto de alteraciones permitía caracterizar los alelos deficientes con buena relación genotipo/clínica, lo que pudimos verificar también en nuestra población⁽²⁾.

Frente a la determinación de 17-OH-progesterona (17-OH-P), marcador metabólico de la HSC21OHD, que en el período neonatal se ve afectada por inmadurez suprarrenal, situaciones de estrés, etc., el genotipo se reconoce como dato analítico que resulta de ayuda en el manejo de los pacientes con HSC⁽³⁾, también en el contexto de la sospecha originada por positivos del cribado neonatal^(4-11). Aunque el marcador determinado en el cribado es la 17-OH-P, se han detectado de forma aislada también otros déficits, que afectan a enzimas situadas en la vía metabólica por encima de este metabolito (al menos ocho casos descritos, el más reciente en 2016)⁽¹²⁾. Esta capacidad es ventajosa, porque facilita la detección de otras formas mucho más infrecuentes de HSC, pero no podemos perder de vista que ello está poniendo de manifiesto la existencia de interferencias analíticas, ya que la 17-OH-P no es el esteroide intermediario que se acumula en estos casos. Los falsos positivos en los inmunoanálisis directos son un hecho reconocido en las muestras neonatales^(12-15).

En la Comunidad de Madrid, en la que este cribado se viene realizando de forma continuada desde 1991, se ha llevado a cabo un genotipado de CYP21A2 sistemático a partir de 2000 en todas las muestras de pacientes positivos y border-line que pasaban a la unidad de seguimiento^(16,17).

El locus CYP21A2 incluye un pseudogén en el que preexisten la mayoría de las mutaciones causales, y hay reordenamientos complejos en los alelos normales y mutados. Un análisis dirigido a las alteraciones frecuentes de CYP21A2 validadas clínicamente aporta la ventaja de evitar la incertidumbre (polimorfismos y variantes raras de interpretación incierta) y facilita descartar la enfermedad. Debe garantizarse la cobertura requerida, especialmente para mutaciones graves y una correcta caracterización de los alelos^(18-24).

El genotipado como herramienta para descartar/ confirmar la enfermedad detectada en el cribado neonatal ha sido reconocido por diversos autores y así fue recogido en la guía de 2010⁽²³⁾. Posteriormente, en la guía de 2018⁽¹⁵⁾ se llamó la atención sobre la inespecificidad de los inmunoanálisis directos de esteroides, acentuando la necesidad de utilizar cromatografía (gases o líquida) acoplada a tándem-masas en su determinación, y se rebajó el interés de los estudios genotípicos, llamando la atención sobre la posibilidad de errores debido a la complejidad del locus y la existencia del pseudogén. Probablemente, la rápida incorporación de los estudios masivos al contexto asistencial pudo afectar al diagnóstico molecular de genes que no se prestan a este tipo de abordajes, porque requieren una amplificación genespecífica y estudio de dosis génica, como es el caso de CYP21A2. Posteriormente, en la guía de 2021⁽²⁴⁾  se vuelve a recoger el hecho de que el genotipado puede ser útil como herramienta de confirmación, siempre manejado desde la experiencia^(4-11).

Se presenta a continuación un resumen de los resultados obtenidos en los estudios moleculares de confirmación poscribado para documentar o, en su caso, descartar los casos detectados en el cribado neonatal de HSC, y detallamos el abordaje molecular que lo ha permitido. La complejidad del locus y de algunas de sus alteraciones, también variantes normales, hace imprescindible un abordaje molecular en que la especificidad y la eficiencia de la amplificación del gen CYP21A2 estén bien controladas, se aborde el estudio de los distintos tipos de alteraciones frecuentes, puntuales y deleciones, y se complete el estudio con la oportuna caracterización complementaria garantizando una interpretación experta de los resultados obtenidos⁽²²⁾.

Materiales y métodos

Se han analizado molecularmente 298 muestras de pacientes que habían sido positivos confirmados del cribado neonatal de HSC procedentes de distintas comunidades autónomas del ámbito nacional, aunque primordialmente provinieron de la Comunidad de Madrid (n = 252). Se trata de casos que habían pasado a la unidad de seguimiento clínico, desde la que se nos solicitó el estudio de CYP21A2. Eran casos no relacionados, con excepción de 11 parejas de hermanos y una familia con tres casos. El análisis molecular realizado se describe en Ezquieta et al^(19,22). Se extrajo el ADN de las muestras de sangre periférica anticoagulada con ácido etilenodiaminotetracético. El gen CYP21A2 se amplifica en tres fragmentos solapantes específicos del gen, y las alteraciones recurrentes se detectan mediante hibridación específica de alelo y Southern (hasta 2008) o amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples para la detección de deleciones, grandes conversiones y duplicaciones génicas. El análisis se complementa con el análisis de los microsatélites D6S273 y D6S439 para detectar posibles homocigotos para alteraciones raras^(22,26), en los que se procedía a la secuenciación complementaria, al igual que en los casos en los que el cribado básico había detectado un único alelo alterado. En los casos en que se detectaron alteraciones de ambos alelos se realizó la segregación en los progenitores, y sólo en 10 casos no se dispuso de muestras para este estudio.

La sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos, positivo y negativo, fueron establecidos a partir de los resultados obtenidos en 620 muestras neonatales, de las cuales 255 fueron negativas en el análisis de CYP21A2: en 136 sólo la elevación de 17-OH-P había motivado la sospecha (n = 110, provenientes del cribado neonatal), y en 119 la clínica de clitoromegalia o hiperpigmentación e hipoglucemia, junto con la elevación de 17-OH-P, habían sido la causa de la solicitud del estudio molecular. Estos resultados se presentaron en comunicación oral en el Congreso de la Sociedad Española de Endocrinología y Nutrición de 2015⁽²⁵⁾ y se recogen en la Tabla 1 (véase ‘Resultados’). Recogemos brevemente en este resumen los resultados en 78 de estos casos (57 varones y 21 niñas) del cribado neonatal de la Comunidad de Madrid⁽¹⁷⁾ genotipados en nuestro laboratorio que fueron seguidos en la sección de endocrinología pediátrica del Hospital Gregorio Marañón, cuyos resultados se recogieron en la publicación mencionada (Figura 1).

Resultados

En la Tabla 1 se aportan los datos de especificidad, sensibilidad y valores predictivos positivo y negativo obtenidos en la aplicación del estudio molecular realizado en 620 muestras (incluyendo sospechas neonatales clínicas y poscribado neonatal). La Tabla 2 y la Figura 2 forman parte del material suplementario recogido en el editorial dedicado al cribado neonatal de HSC⁽¹⁶⁾. La Tabla 2 recoge los puntos claves del genotipado de CYP21A2 que nos ha permitido detectar/descartar/clasificar correctamente los pacientes cuyo dato del cribado neonatal había desencadenado la sospecha de HSC. En la Figura 2 se muestra el esquema del estudio mediante el que se descartan o, en su caso, detectan las alteraciones, y se documentan y clasifican los genotipos de CYP21A2.

El cribado básico tiene un alto valor predictivo negativo (99,6%), ya que sólo pacientes heterocigotos compuestos en que ambos alelos fueran raros no se detectarían. La frecuencia de este evento en la serie conjunta de pacientes con formas graves caracterizados molecularmente en nuestro laboratorio desde 1995 ha sido de 1/468. Es algo menos infrecuente (5/468) el caso de pacientes homocigotos, generalmente por consanguinidad no conocida para alteración rara (no incluida en el cribado básico), y el estudio de microsatélites^(22,26) permite evitar estos potenciales falsos negativos. El valor predictivo positivo es algo menor (96,1%), dado que los portadores de alteración grave (un alelo mutado) serán inicialmente positivos y en ellos hay que plantear de forma inmediata la secuenciación complementaria de CYP21A2. Queremos señalar que, de detectarse alguna alteración, ésta debe interpretar se cuidadosamente, ya que no es infrecuente que puedan detectarse variantes raras que tan sólo son polimorfismos⁽²⁷⁾.

Los resultados obtenidos en los 298 estudios poscribado neonatal fueron los siguientes: 196 muestras fueron negativas para el cribado molecular de CYP21A2 básico (alteraciones puntuales recurrentes e híbridos de deleción con punto de ruptura intragénico seguido de dosis génica para deleciones y grandes conversiones no amplificables, y detección de duplicaciones del gen como estudio complementario), que fue negativo o sólo documentó una alteración leve (n = 8) o un alelo con duplicación génica que incluía p.Gln319* (n = 9). El estudio complementario de microsatélites no detectó homocigosis en ninguna de las muestras que eran negativas, y se descartó que pudiera existir una variante grave rara en homocigosis por consanguinidad^(22,26). Se detectaron cinco portadores de alteración grave y en cuatro de ellos el estudio complementario de secuenciación no detectó una segunda alteración, por lo que se descartó también la enfermedad. En uno de los casos se detectó una variante incierta cuya segregación familiar sugería que no tenía impacto fenotípico⁽²⁷⁾, y el seguimiento clínico posterior demostró que esta interpretación era correcta.

El cribado básico de CYP21A2 fue positivo en 96 de los casos (dos alteraciones segregadas), 70 formas clásicas (18 de ellas formas VS) y 26 formas no clásicas. Aunque estas últimas no son objeto del cribado neonatal, ya que no implican la necesidad de atención clínica en ese momento, es importante discriminarlas correctamente. A diferencia de las formas NC, que no requerirán ningún tipo de atención clínica neonatal y en las que no es de esperar una evolución clínica rápida, las VS, aunque no presentarán clínica neonatal en los varones, sí requerirán seguimiento inmediato y, en caso de que se plantee un nuevo embarazo, asesoramiento familiar. De cualquier manera, en las formas no clásicas detectadas que sean heterocigotas compuestas con un alelo grave, deberá aportarse el asesoramiento familiar.

La evolución clínica de 78 de estos pacientes durante 12 meses por la unidad de seguimiento del cribado neonatal de HSC de la Comunidad de Madrid del Hospital Gregorio Marañón se recogió en la publicación de 2011 de Huidobro et al⁽¹⁷⁾. Cuarenta y tres casos en los que finalmente se descartó la enfermedad, se etiquetaron como ‘elevaciones transitorias de 17-OH-P’ en esta publicación y habían resultado negativos en el genotipado de CYP21A2. La normalización de las determinaciones de 17-OHP no se alcanzó hasta los seis meses en un 50%, y en el resto, al año. De los 33 casos en que CYP21A2 había sido positivo, 24 fueron pacientes con forma clásica, mientras que nueve eran también casos con HSC, aunque ‘crípticos’ en la etapa neonatal (casos virilizantes en varones y formas no clásicas en ambos sexos); los genotipos habían clasificado correctamente a estos pacientes (Figura 1).

Hemos tenido ocasión de poner de manifiesto otros casos positivos del cribado de varones sin clínica neonatal con formas clásicas VS y también formas no clásicas heterocigotas compuestas con alteración grave. En la Figura 3 se recoge el pedigrí familiar de uno de estos casos (del cribado de Castilla y León, presentado en el Congreso de la Sociedad Española de Medicina de Laboratorio de 2022)⁽²⁸⁾. El caso índice es un neonato de 19 días con cribado positivo para HSC –17OHP de 13,5 nmol/L a las 48 horas y 140,6 nmol/L a los 12 días (valor de referencia: <11,7 nmol/L) en la prueba del talón–. En el control analítico destacaba una 17-OH-P sérica de 65,25ng/mL (valor de referencia: 0,42-2,91 ng/mL), clínicamente asintomático. En el genotipado de CYP21A2 detectamos las variantes c.955C>T (p.Gln19*) y c.92C>T (p.Pro31Leu) en heterocigosis compuesta. Ambas variantes requieren estudios complementarios para clasificarlas correctamente.

Para la variante c.955C>T (p.Gln19*), alteración puntual grave, se descartó el patrón molecular p.Gln19* con duplicación génica^(21,22) que se encuentra en población general y no asocia la deficiencia, y se trata, por tanto, del alelo grave (relacionado con un 0% de actividad enzimática in vitro). Para la variante c.92C>T (p.Pro31Leu), variante puntual leve, se descartó la conversión en 5’ que incrementaría la gravedad de este alelo⁽²²⁾, y se consideró el alelo leve (un 20-50% de actividad enzimática). La segregación de las alteraciones se estableció en el estudio de progenitores (Figura 3). La heterocigosis compuesta de alteraciones leve y grave se asocia con la forma no clásica de HSC. Concomitantemente a la detección del caso índice en el cribado, el hermano de 4 años había presentado pubarquia precoz y aceleración de la edad ósea, con 17-OH-P sérica de 59 ng/mL (valor de referencia: 0,14-1,41 ng/mL). El genotipado de CYP21A2 reveló que presentaba las alteraciones detectadas en el caso índice y era, por tanto, también una forma no clásica de HSC, heterocigota compuesta con alteración grave. Revisando su cribado neonatal (17-OH-P de 15 nmol/mL), se repitió en tres ocasiones, sin ascenso en sucesivos controles, por lo que se consideró normal.

El padre presentó en el cribado básico complementario de las alteraciones recurrentes una segunda alteración puntual leve, c.1360C>T (p.Pro454Ser) en su segundo alelo (no heredado por el caso índice), por lo que sería una forma no clásica; en este caso, ambas alteraciones eran leves. La hermana más pequeña, una niña sana cuyo cribado neonatal fue normal, presentaba a los dos años una 17-OH-P sérica ligeramente elevada de 3,2 ng/mL (valor de referencia: 0,14-1,41 ng/mL). El análisis molecular reveló que presentaba la alteración grave de la madre c.955C>T (p.Gln19*) y la alteración leve del segundo alelo paterno c.1360C>T (p.Pro454Ser); era, por tanto, también heterocigota compuesta. En la actualidad, aunque ninguno de ellos presenta insuficiencia suprarrenal y se trata de formas no clásicas, su expresividad ha sido más manifiesta con la edad y los tres hermanos se encuentran en seguimiento con el endocrinopediatra.

Discusión

Se considera que, en una enfermedad recesiva, el genotipo permitirá descartar la enfermedad en >95% de los casos siempre que el estudio molecular aplicado detecte no menos del 80% de las alteraciones causales en esa población. Ello se debe a que, de no detectarse la alteración, al ser dos los alelos que hay que caracterizar, se multiplican las probabilidades de no detectarlo (20% × 20%), y la probabilidad conjunta de no detectarlo es del 4% y, por tanto, menores del 5% los falsos negativos del genotipado. No debe olvidarse que se detectarán portadores que, no siendo afectos, serán positivos para este planteamiento, y se requerirá un análisis secundario del gen completo. Éste fue el planteamiento seguido en la implementación del cribado de la fibrosis quística. En comparación con el genotipado CFTR incluido en el propio cribado neonatal de la fibrosis quística, CYP21A2 tiene la ventaja de que la batería limitada de alteraciones frecuentes (puntuales y deleciones) que se aplica garantiza una cobertura superior (>90%), por lo que la probabilidad de falso negativo genotípico es todavía menor (<1%) y, además, es algo menor la frecuencia de portadores en la población general. CYP21A2 tiene en contra la complejidad del locus que se debe analizar, una mala adaptabilidad a las técnicas de alto rendimiento y la necesidad de contar con experiencia en este locus concreto^{(4-11,15,16,19-22)}. Existe un segundo factor, que no siempre se contempla, que también tiene importancia como falso negativo genotípico, que es el caso de los individuos homocigotos para una alteración rara, que escapan a este cálculo y que pueden ser detectados si se aplica un análisis de polimorfismos informativos de tipo microsatélite^(22,26), que reduce todavía más la probabilidad de que el cribado básico de CYP21A2 no detecte a los pacientes afectos. Al detectar individuos homocigotos que podrían presentar una misma alteración rara en ambos alelos, se procede a su secuenciación complementaria.

Dirigir el estudio exclusivamente a las alteraciones recurrentes no sólo facilita el abordaje que se debe aplicar en estudios por series cuyo coste puede ajustarse al máximo, sino que también permite evitar la detección de variantes inciertas, que en su gran mayoría corresponden a polimorfismos inocuos o variantes funcionales muy leves sin trascendencia clínica y que no requieren ningún tipo de intervención clínica. En contextos asistenciales en que no se ha desarrollado la enfermedad (como es el cribado neonatal), estas variantes resultan especialmente ‘engorrosas’, porque generan una incertidumbre adicional.

En el conjunto de estudios de CYP21A2 poscribado neonatal realizados desde 2000, hemos podido descartar la enfermedad en el 68% de los casos que habían sido positivos confirmados del cribado y en cuyo seguimiento por parte de las unidades clínicas se mantenían valores elevados de 17-OH-P y se solicitó su análisis molecular. Por otro lado, hemos podido confirmar y clasificar la HSC en el resto de los casos cuyo estudio se nos solicitó. La utilidad del análisis de CYP21A2 en nuestra población se documentó⁽¹⁷⁾ en el seguimiento de 78 casos positivos del cribado neonatal de HSC de la Comunidad de Madrid.

El genotipo de CYP21A2 es notablemente informativo para la HSC y puede utilizarse en los casos positivos del cribado neonatal (con o sin clínica) para descartar, confirmar y clasificar la enfermedad; sin embargo, es imprescindible disponer de un análisis y una interpretación expertos, dadas las especiales características del locus. El genotipado de CYP21A2 ha permitido, aun en ausencia de un segundo nivel bioquímico adecuado (cromatografía-masas), unos resultados informativos que han permitido evitar la ansiedad de las familias y clasificar clínicamente a los pacientes garantizando una atención inmediata o un seguimiento acorde (formas graves frente a formas leves). Se han podido descartar tempranamente los casos no afectos (en que todavía se mantenía la elevación de la 17-OH-P) y discriminar las formas que no son objeto del cribado, pero que en ocasiones se detectan y que no requieren atención neonatal, como las no clásicas. Por otro lado, en los casos con formas graves, aunque estuvieran ya perfectamente definidos, el dato genotípico de CYP21A2 abre la posibilidad del asesoramiento familiar si existen alteraciones graves; y, lo que es más importante todavía, en las formas VS de los varones (crípticas todavía en esta etapa neonatal) permite su diagnóstico y así garantiza un seguimiento adecuado, ya que una rápida evolución clínica puede dificultar una intervención adecuada⁽¹¹⁾.

Considerando que en la actualidad la HSC se encuentra ya en la cartera básica del Sistema Nacional de Salud, debería ofrecerse el genotipado experto de CYP21A2 a todas las unidades de cribado que puedan requerirlo (para clasificar la forma clínica y en positivos sin clínica neonatal las formas VS en varones y NC en ambos sexos). CYP21A2 es un locus complejo que requiere experiencia (no se dispone de equipamiento/kit comercial específicos, a diferencia de otras enfermedades detectadas en el cribado). El genotipo de CYP21A2 seguirá requiriéndose para confirmar/descartar la enfermedad cuando la elevación de la 17-OH-P sea real, pero derivada de una situación de estrés o inmadurez suprarrenal por prematuridad.

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